La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica utilizzata in medicina e nella ricerca in biologia molecolare per produrre migliaia o addirittura milioni di copie di una sezione di DNA, come un gene specifico. Tale processo, chiamato amplificazione, consente a scienziati, ricercatori e medici di prelevare un piccolo campione di DNA bersaglio e di amplificarlo per creare una quantità sufficientemente grande da poter essere studiata in dettaglio.
Le copie di DNA prodotte dalla reazione a catena della polimerasi possono essere utilizzate in molte applicazioni che spaziano dalla ricerca di base alla diagnosi delle malattie, ai test agricoli e alle indagini forensi. Il Progetto Genoma Umano, ad esempio, si è basato molto sulla reazione a catena della polimerasi per le sue tecniche di mappatura.
La reazione a catena della polimerasi è considerata come uno dei più importanti progressi scientifici nella biologia molecolare, che ha rivoluzionato lo studio del DNA a punto che il suo creatore, Kary B. Mullis, assieme a Michael Smith, è stato insignito del premio Nobel per la chimica nel 1993.
DNA polimerasi
dna polimerasi
La reazione a catena della polimerasi ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della duplicazione cellulare che in natura è svolto dalla DNA polimerasi, enzimi responsabili della sintesi del DNA in tutte le forme di vita. Il loro ruolo è quello di replicare in modo accurato ed efficiente il genoma per garantire il mantenimento delle informazioni genetiche e la loro fedele trasmissione attraverso le generazioni.
Gli enzimi di questa classe catalizzano la polimerizzazione dei 2′-desossiribonucleotidi lungo un filamento di DNA, che l’enzima “legge” e utilizza come stampo. La reazione procede con la partecipazione dei 2′-desossinucleoside-5′-trifosfati che vengono incorporati nel filamento di DNA come 2′-desossinucleoside-5′-monofosfati, con un rilascio di pirofosfato.
Il tipo di nucleotide da incorporare è determinato dal principio di complementarietà con il nucleotide situato nel modello che viene letto. Pertanto, la molecola appena sintetizzata è completamente complementare al filamento modello e identica a uno dei filamenti della doppia elica del DNA. Questo processo è chiamato replicazione.
Fasi della reazione a catena della polimerasi
Un singolo ciclo avviene in tre fasi. Nella prima fase che implica la denaturazione il modello di DNA a doppio filamento è riscaldato a 94-95⁰C per un tempo compreso tra 15 e 30 secondi. L’elevata temperatura provoca la rottura dei legami a idrogeno tra le basi in due filamenti di DNA stampo e la separazione dei due filamenti.
fasi
Nella fase di denaturazione si ottengono quindi in due singoli filamenti di DNA, che fungeranno da modelli per produrre le nuove copie di ciascun filamento di DNA. In questa fase è necessario che la temperatura sia mantenuta per un tempo sufficientemente lungo da garantire la completa separazione dei filamenti di DNA.
Nella seconda fase avviene la ricottura in cui la temperatura è abbassata per consentire ai primer del DNA di legarsi a un punto specifico del DNA stampo a singolo filamento mediante legame a idrogeno.
Tale fase avviene in un tempo di circa 10-30 secondi e la temperatura è solitamente è compresa tra 50 e 65⁰C. I due filamenti separati di DNA sono complementari e corrono in direzioni opposte (da un’estremità, l’estremità 5′, all’altra, l’estremità 3′). Di conseguenza, ci sono due primer, un primer forward e un primer reverse.
La ricottura è essenziale perché i primer servono come punto di partenza per la sintesi del DNA, fornendo una breve regione di DNA a doppio filamento con cui può agire l’enzima polimerasi. Solo quando il primer si è legato, l’enzima polimerasi può legarsi e iniziare a creare il nuovo filamento complementare di DNA dalle basi di DNA libere, nel passaggio di estensione.
Nella terza e ultima fase di un ciclo avviene l’estensione detta anche amplificazione in cui la temperatura è aumentata a 72⁰C per consentire la produzione di nuovo DNA da parte di uno speciale enzima Taq DNA polimerasi,
amplificazione
ricavato dai batteri Thermus aquaticus che sono termofili per natura e come tali hanno polimerasi termostabili che rimangono attive a temperature superiori alla temperatura di denaturazione del DNA, rendendo possibile utilizzare la reazione a catena della polimerasi su campioni di DNA senza la necessità di aggiungere nuove DNA polimerasi dopo ogni ciclo.
Taq polimerasi
La Taq DNA polimerasi è una è una proteina di 832 amminoacidi opera a una temperatura ottimale di 72 °C, alla quale i nucleotidi vengono incorporati a una velocità di 2-4 kilobasi al minuto.
Alla temperatura di 72⁰C, la Taq polimerasi inizia a costruire il filamento complementare legandosi al primer e poi aggiungendo basi di DNA al singolo filamento una alla volta nella direzione 5′-3′. Grazie all’azione di questo enzima si ottiene un filamento di DNA e una molecola di DNA a doppio filamento.
La durata di questo passaggio dipende dalla lunghezza della sequenza di DNA che è amplificata. Di solito ci vuole circa un minuto per copiare 1.000 basi di DNA.
Termociclatore
Il processo della reazione a catena della polimerasi è ripetuto da 20 a 40 volte, in cui si raddoppiano ogni volta il numero di copie di DNA secondo una progressione geometrica. A causa della natura della terza fase di amplificazione, sono necessarie pochissime copie del campione di DNA per un’amplificazione di successo e, in quanto tale, questa tecnica è utile in molte applicazioni, tra cui l’analisi di prove forensi, l’esame di campioni costituiti solo da diverse cellule o microbi.
Il processo della reazione a catena della polimerasi è eseguito da un termociclatore che è progettato per regolare il trasferimento di calore e fornire un controllo preciso della temperatura. Lo strumento può essere completamente programmato per ogni fase di un protocollo di della reazione a catena della polimerasi e più protocolli possono essere memorizzati per un uso ripetuto.
Gli elementi di progettazione chiave di un modello di termociclatore standard includono un blocco campione composto da un metallo termoconduttore come, ad esempio, alluminio e argento, moduli termoelettrici per una rapida funzione di riscaldamento e raffreddamento e un coperchio riscaldato e sigillante per impedire l’evaporazione dei campioni.
In particolare, l’uso di moduli termoelettrici è significativo per ottenere uno strumento autonomo con doppi requisiti di riscaldamento e refrigerazione. A seconda della velocità della macchina, la reazione a catena della polimerasi può essere eseguita in meno di un’ora o fino a qualche ora.
